食品中氯丙醇酯、缩水甘油酯测定的整体解决方案Ⅰ—— GB 5009.191-2024

试样中加入同位素内标，用氢氧化钠-甲醇溶液进行酯键断裂反应，3 -氯- 1,2-丙二醇酯、2-氯-1,3-丙二醇酯和缩水甘油酯分别转化为游离态3 -氯- 1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、缩水甘油（Gly）和相应的脂肪酸甲酯；以酸性溴化钠溶液进行中和，生成的缩水甘油转化为稳定的 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）；试液经净化去除脂肪酸甲酯等杂质后，进行苯基硼酸衍生，以气相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量。

酯键断裂反应中，生成的游离态3-MCPD在碱性条件下会部分转化成缩水甘油，经酸性溴化钠溶液作用生成3-MBPD；同位素13C3-3-MCPD在相同条件下转化成13C3-3-MBPD的比例和3-MCPD转化成3-MBPD的比例一致，通过转换关系对试液中总缩水甘油含量进行修正，得到试样中缩水甘油酯含量。

实验用到的标准品信息见下表：

表1 标准品信息

2.1 标准品溶液配置

氯丙醇酯混合标准中间液（10 μg/mL）：分别准确移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6个月。

氯丙醇酯混合标准工作液CaL I（2 μg/mL）：准确移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混标中间液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

氯丙醇酯混合标准工作液CaL II（0.2 μg/mL）：准确移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合标准工作液I，用甲苯定容至10 mL。临用现配。

缩水甘油酯标准中间液（10 μg/mL）：准确移取1 mL 100 μg/mL 缩水甘油酯标准溶液至10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存，保存期 6个月。

缩水甘油酯标准工作液CaL I（2 μg/mL）：准确移取1 mL 10 μg/mL 缩水甘油酯标准中间液，用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

缩水甘油酯标准工作液CaL II（0.2 μg/mL）：准确移取1 mL 2 μg/mL 缩水甘油酯标准工作液I，用甲苯定容至10 mL。临用现配。

内标混合标准工作溶液（13C3-3-MCPDE:2µg/mL，D5-2-MCPDE:2µg/mL，D5-GE：2µg/mL）：分别准确移取0.4 mL 50 μg/mL 13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE标准溶液到10 mL容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。于-20 ℃保存，保存期 3个月。

2.2 标准曲线配制

按照下表所示，分别配制氯丙醇酯标准曲线和缩水甘油酯标准曲线。加入甲苯、叔丁基甲醚（tBME）、内标工作溶液和相应的混合标准工作溶液，按照“样品前处理"进行操作，上机检测得到标准曲线。

表2 氯丙醇酯标准曲线的配制

表3 缩水甘油酯标准曲线的配制

标准品配制注意事项：

1、氯丙醇酯浓度均以对应的氯丙醇计，缩水甘油酯浓度以缩水甘油计，定量计算中需特别注意。

2、如使用纯品型标品，需注意计算标品的纯度和对应的折算系数。建议选择安谱璀世溶液型标品，进行稀释配制，操作更加方便。

3、为确定反应过程中3-MCPD在转化成缩水甘油的含量，本方法需要分别配制氯丙醇酯和缩水甘油酯两组标准曲线，但内标为同位素标记，可以不进行分开配制，将13C3-3-MCPDE、D5-2-MCPDE和D5-GE三者混合使用。

试剂配置：

硫酸水溶液（25%）：将25 mL硫酸转移至含有50 mL纯水的100 mL容量瓶中。用纯水稀释至刻度线并混匀。

酸性溴化钠溶液（溴化钠600 g/L）：将60 g溴化钠溶解于70 mL纯水中。将溴化钠溶液转移至含有3.5 mL 25%硫酸溶液的100 mL容量瓶中。用纯水稀释至刻度线并混匀。

氢氧化钠-甲醇溶液（0.35 mol/L）：称取1.4 g 氢氧化钠，加入甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，转移至塑料瓶中，储存于10℃下。临用现配。

苯硼酸溶液：称取12.0 g苯硼酸，加入100 mL的95%丙酮水溶液，混匀。溶液可在室温下储存三个月。

乙_醚-石油醚溶液（1+1）：量取乙_醚和石油醚各100 mL，混匀。

1%乙二醇溶液：移取 100 µL乙二醇，加水定容至10 mL，混匀。

试样提取：

准确称取婴幼儿配方奶粉试样0.5 g（精确至1 mg）于40 mL玻璃螺纹样品瓶中，准确加入100 µL混合内标工作液（2 µg/mL）；加入2 mL 65 ℃±5 ℃水，涡旋混匀，再加入1 mL氨水，盖塞涡旋混匀，在65℃±5℃水浴下振荡30 min，取出后冷却至室温。加入3 mL乙醇，涡旋后加入5 mL乙_醚，振摇5 min，然后加入5 mL石油醚，继续振摇5 min。待溶液静置分层后，取上层溶液于40 mL玻璃样品瓶中；再加入乙_醚和石油醚各5 mL，重复萃取1次，合并有机相于40℃下氮吹浓缩至干，用2 mL乙_醚-石油醚溶液（1+1）淋洗样品瓶内壁，将洗液转移至8 mL玻璃螺纹样品瓶中，于40 ℃下氮吹至干，供碱水解。

碱水解（酯键断裂反应）：

向提取样品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚（tBME）。涡旋混匀30 s，10°C水浴冷却6 min。

加入预冷的200 µL氢氧化钠-甲醇溶液（0.35 mol/L），涡旋混匀10 s，继续10°C水浴7 min进行酯键断裂反应。然后加入600 µL酸化溴化钠水溶液（溴化钠600 g/L），涡旋混匀10 s，停止反应。让温度稳定在室温静置至少5 min，以使所有缩水甘油完_全转化为3-MBPD。

试样净化：

在样品中加入600 µL异辛烷，涡旋混匀10 s，取出上层有机相，弃去。再加入600 µL异辛烷，涡旋10 s，然后取出上层有机相，弃去，注意不要取到任何水层。

衍生化反应：

向净化液中加入100 µL苯基硼酸溶液，涡旋30 s后，加入100 µL 1%乙二醇溶液和1.0 mL异辛烷，涡旋，静置分层，必要时可离心使分层彻_底，取上层溶液至装有约0.3 g无水硫酸钠的玻璃样品瓶中，涡旋混匀10 s，提取液过0.22 μm的疏水性PTFE针式滤器后供气相色谱-串联质谱仪进行测定。

前处理注意事项：

1、0.35 mol/L甲醇钠溶液建议存放在4℃条件下，建议至少存放2h以上，临用前拿出；

2、10°C低温酯交换反应时需尽量将整个螺纹瓶浸泡在水中，以保证螺纹瓶内温度稳定；

3、前处理过程中尽量避免使用塑料耗材，可使用玻璃螺纹瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手动进样针等耗材，建议进行方法空白实验监控过程本底情况；

4、建议使用疏水性PTFE针式滤器进行过滤；

5、前处理过程中会存在3 -氯- 1, 2-丙二醇酯转换生成的缩水甘油（Gly）的副反应，在上述条件下，13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕榈酸双酯（13C3-3-MCPD-PP）转换为13C3-Gly的转换率需控制在10%左右，如转换率过高需排查前处理过程，转化率偏高的主要原因可能是温度控制不理想导致；

6、在上述条件下，2-MCPD可转化为缩水甘油的比率<1%，可以忽略不计。

仪器维护注意事项：

1、随着进样次数的增加，仪器轻微污染，目标物保留时间可能发生偏移；

2、该实验对仪器污染比较严重，仪器受到严重污染后，可能导致目标物响应降低、分离度变差等情况，需注意仪器的清洗维护，包括进样针的清洗，离子源的清洗，色谱柱的老化等；

3、如仪器配制程序升温进样口和反冲功能，可明显降低对仪器的污染程度。

4、建议色谱柱加装2m相同固定相的预柱，定期对预柱进行更换，可延长色谱柱的使用寿命。

6.1 标准曲线数据

以标准工作液中标准品的质量（以醇计）为横坐标，以标准品与对应内标的峰面积比为纵坐标，绘制3-MCPDE、2-MCPDE 和 GE 的标准曲线，标准曲线见表5。

以氯丙醇酯标准系列衍生液中 3-MCPD 与13C3-3-MCPD 的峰面积比为横坐标，3-MBPD 与13C3-3-MBPD 的峰面积比为纵坐标，绘制 3-MCPD 转化为 3-MBPD 的标准曲线，用于计算试液中 3-MCPDE水解产物 3-MCPD 转化为 3-MBPD 的峰面积，标准曲线见表5。

表5 标准曲线

6.2 加标回收率数据

本次实验方法空白未检出氯丙醇酯和缩水甘油酯，奶粉样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的本底含量分别为0.033、0.019、0.008 mg/kg，其中缩水甘油酯含量的计算已经校正了3 -氯- 1,2-丙二醇酯的转换影响。

样品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率数据见下表。

表6 奶粉基质的加标回收率数据（n=3）

数据计算注意事项：

1、本实验3-氯丙醇酯使用13C3-3 -氯- 1,2-丙二醇棕榈酸双酯作为定量内标；2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸双酯作为定量内标；缩水甘油酯使用D5-缩水甘油棕榈酸酯作为定量内标；

2、缩水甘油酯是通过前处理转换为 3-溴-1,2-丙二醇（3-MBPD）进行上机检测；

3、样品中缩水甘油酯GE的计算需扣除3 -氯- 1, 2-丙二醇酯转换生成的缩水甘油（Gly）的影响，转换量（GE 的高估值）需要通过试液中 3-MCPD 转化而成的 3-MBPD 的峰面积A1进行计算，而A1需要通过3-MCPD 转换 3-MBPD 的标准曲线进行计算得到。计算中需注意不同计算目的的内标选择。

4、样品中氯丙醇酯浓度均以对应的氯丙醇计，缩水甘油酯浓度以缩水甘油计，计算中需特别注意。

使用安谱实验标准品和相关耗材，参照国标《GB 5009.191-2024 食品安全国家标准 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、缩水甘油酯的测定》第二篇第一法，快速碱水解方法，使用同位素内标法进行定量，3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和缩水甘油脂肪酸酯的回收率在90%-110%之间，RSD小于11%。该方法操作简便，快速，稳定，能够很好的满足奶粉基质中氯丙醇酯和缩水甘油酯的检测。